【科学世界】2015年诺奖解读:抗疟青蒿素—祝贺青蒿素发现工作获得诺贝尔奖

   记者/孙天任 

     缘起

   此前,诺贝尔奖已经4次颁发给了疟疾相关研究,足见学术界对它的重视。1884年,阿方斯?拉韦朗(Alphonse Laveran)确认疟疾是由原生动物疟原虫引起的,而非之前认为的细菌,1907年获奖。1897年,英国人罗纳德?罗斯(RonaldRoss)确认蚊子是传播疟疾的元凶,1902年获奖。1939年,瑞士人保罗?穆勒(Paul Miller)发现DDT具有强大的消灭昆虫的效果,可用以杀灭蚊子预防疟疾,1948年获奖。而最有意思的是1927年生理学或医学奖获得者、奥地利人朱利叶斯?瓦格纳-尧雷格(Julius Wagner-Jauregg),他并非因治疗疟疾知名,而是用疟疾治病得奖,他使用间日疟原虫引起的长期高烧治疗神经性梅毒导致的麻痹性痴呆,取得了很好的疗效,而疟疾当时可以用奎宁治疗,因此这种治疗是可以被接受的。 

  自有人类以来,疟疾就如影随形。四种能够感染人的疟原虫—间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫在上万年间,与人类展开了针锋相对的生存竞争,甚至人类的基因都为之变异。在西非和中非,人们演化出了Duffy血型,使得红细胞表面的Duffy抗原缺失,阻断了间日疟进入红细胞的通道。而针对危害性最大的恶性疟,非洲人还演化出了镰状细胞贫血,这是β珠蛋白基因单一碱基突变导致的性状,可将恶性疟的死亡率降低90%。但杀敌一千,自损八百,遗传了镰状细胞贫血基因纯合子的婴儿将很难活到成年。此外,珠蛋白生成障碍性贫血(地中海贫血),葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(蚕豆?。┑榷嘀忠糯膊?,均属于此类代价巨大的抗疟方式。  

  人类与疟疾的残酷斗争不但镌刻在基因里,也记载在文字中。古人避如蛇蝎的南方瘴气,其实就是肆虐的疟疾。中医所载成百上千的治疟方法,也反映了古代人对疟疾的抗争与无奈。直到1820年,人们才从南美洲土人治疗疟疾的金鸡纳树树皮中提炼出了有效成分奎宁。以后又发明了氯喹等药物,但疟原虫并没有束手待毙,随之演化出了抗药性。直到今天,疟疾仍然是人类的最大威胁之一,每年杀死超过60万人,有2亿人因 为患病而常常连续数日卧床不起。 

  奎宁及其类似物如氯喹等曾经救过无数人的生命。但在20世纪60年代的东南亚地区,疟原虫对这些药物的抗药性已经十分严重。此时,美国-越南战争正在印度支那半岛激烈展开,战争双方均面临着疟疾的严重威胁,寻找新的抗疟药物成为当务之急。为此,越南方面向中国提出了协助解决疟疾困扰的要求,中国领导人接受了这一要求,在他们的指示下,国家科委和解放军总后勤部于1967523日召开了“疟疾防治药物研究工作协作会议”,由此确立了由全国多部门参加的、以疟疾防治药物研究为主要目标的任务。由于军事保密需要,这一军工项目遂以523日开会日期为代号,称为“523任务”。 

  发现 

  按专业任务,523任务初始成立了化学合成药、中医中药、驱避剂、现场防治4个专业协作组。其中与抗疟药物相关的是筛选已有化合物和合成新化合物的化学合成药组,以及从中医药方面筛选天然化合物的中医中药组。 

  1969年,国家卫生部中医研究院中药研究所(以下简称北京中药所)参加523任务,屠呦呦担任组长,组员为余亚纲,他们两人 都毕业于北京医学院药物系,接受了现代科学研究方法的训练,并在中医研究院西医学习中医研究班中学习了本草学的发展历史。其后倪慕云、钟裕蓉等相继加入。同年4月,中医研究院革委会业务组编写了含有640余方的《疟疾单秘验方集》,屠呦呦等人从中筛选出了对鼠疟效果较好的胡椒 提取物参加海南现场试验,但临床结果并不好?;氐奖本┖?,余亚纲再次查阅中医药文献,摘出了800余条方剂,提出“重点筛选药为乌梅、乌头、鳖甲、青蒿※等”。他认为这几种药物在方剂中既有作单方使用,又在复方中频繁出现,值得反复筛选。其中青蒿在 当时已被高邮等地区民间用作抗疟药物。在军事医学科学院进行鼠疟筛选中,青蒿的乙醇提取物曾出现约70%左右的抑制率,仅次于雄黄,但不稳定。此后,余亚纲调离项目组,转而参与老年慢性支气管炎研究。 

  1971年下半年,屠呦呦复筛在过去试验中表现出较高效价的中药,但青蒿95%乙醇提取物的鼠疟抑制率仅为40%。屠呦呦重新 汲取东晋葛洪《肘后备急方》中青蒿截疟的经验,从“青蒿一握,以水一升渍,绞取汁,尽服之”中领悟到,青蒿抗疟的有效物质可能在亲脂组分中、且忌高温。于是改用乙醚低温提取,效价显著提 高,鼠疟抑制率达99%100%,但毒性较大。而后去除提取物中的酸性组分,保留了中性组分。经反复实验,终于在1971104日获得的191号的青蒿中性提取物样品中,展现出了对鼠疟100%的抑 制率。19723月,屠呦呦于南京在523中草药专业会议上报告了这一成果,得到了广泛关注。 

  现在分析起来,使用酒精提取青蒿时,将水溶组分和油溶组分一并提取了出来,因此其中的有效物质青蒿素的含量比较低,效果不佳。而现在知道,青蒿素结晶即使加热到熔点157℃也不会分解,但在酒精溶液中,尤其在高温下,青蒿素可能与溶液中微量的亚铁离子发生反应,失去活性。因此在低温下用亲脂溶剂提取是可取的。低温提取在植物化学中是常规方法,但是用乙醚提取却是很少见。在化学实验室的人尽量不用乙醚,因为其沸点仅34.6℃,很难回收,而且易燃易爆,是危险品。更不用说在工厂大规模使用了。但在屠呦呦对青蒿素的实验中,用乙醚提取却闯出了一片新天地。   

  验证 

  1972810月,屠呦呦等赴海南进行了中性提取物“醚中干”的20余例临床试验,取得了很好的效果。此时,在北京的组员对中性提取物进行了进一步的纯化,118日,钟裕蓉由氧化铝柱层析改用硅胶柱层析,分得了三种结晶,并通过鼠疟筛选证实其中结晶II是唯一有效的单体,并命名为“青蒿素II”。在1973910月使用青蒿素II进行的临床床试验中,对间日疟有效,但未证实对恶性疟的效果。 

  受到北京中药所青蒿素中性提取物的启示,云南省药物研究所的罗泽渊在云南大学校园内发现很多苦蒿,便特意采集了一些带回研究所,并于19734月用乙醚提取物分离直接得到有效结晶单体。经中科院昆明植物研究所吴征镒鉴定,这种苦蒿是黄花蒿的变型,即大头黄花蒿,于是将这一结晶称为“黄蒿素”。同年6月,由于当地资源少,云南省药物研究所又从四川省酉阳地区(今重庆酉阳)购来了一批黄花蒿,发现其中黄蒿素的含量比云南的大头黄花蒿高出了10倍。他们发现的优质黄花蒿和后来改进的“溶剂汽油法”提取工艺,为青蒿素的大规模生产奠定了基础。 

  197311月,山东中医药研究所魏振兴等也提取出了有效单体,并命名为“黄花蒿素”。云南和山东提取的有效单体在临床上应用良好,并最终确认和北京中药所的青蒿素II是同一种物质,统一命名为“青蒿素”。现在已经知道,各地青蒿药材中的青蒿素含量大不相同,北方和长江下游地区以及国外的青蒿中青蒿素含量很低,只有云贵四川一带的青蒿中青蒿素含量较高。并且青蒿素在青蒿开花前含量最高,开花后就迅速降低,这可能就是此前筛选中抗疟效果忽高忽低的原因。 

  随着广州中医学院李国桥等人大规模临床试验的顺利开展,青蒿素治疗疟疾大获成功。确定化学结构的工作也随之展开。北京医学院林启寿初步判断屠呦呦提供的样品是萜类化合物。1973年年底,屠呦呦来到中科院上海有机化学研究所(以下简称有机所),计划请萜类专家刘铸晋进行分析,但此时刘铸晋改行研究液晶,所以没有接受这项任务,而由植化专家陈毓群接待。1974年春节过后,陈毓群被下放到五七干校,于是又安排给了当时避孕药组的负责人陶正娥,由组内甾体植化专家吴照华接受了任务。当时很多研究都停止了,基础研究大多靠边站,只有523这样的军工任务与避孕药这样的国家任务能够正常进行。 

  此时,北京中药所倪慕云等来到有机所共同开展工作,对样品重新进行了纯化重结晶,随之进行了碳氢分析,核磁共振氢谱和碳谱,以及质谱等测试,同时也开展了一系列青蒿素化学反应的研究,以此推测青蒿素的结构。当时现代化的仪器很少,所幸是军工项目,能够使用全国仅有的几台高级仪器。并由此很快得出了分子式C15H22O5,分子量282.34,不含氮。而当时已有的抗疟药都是像奎宁一样的芳香杂环类化合物,分子中都含氮原子。青蒿素分子式的另一个特点就是氧原子多,在15个碳原子的分子中竟含有5个氧原子,那么,这5个氧原子在分子结构中该怎么安排,有没有可能是过氧化物?有机化学中的一个常识是过氧化物容易爆炸,但青蒿素却是相对稳定的一个分子,当时便因此否定了。 

  19754月,中国医学科学院药物所的于德泉在523项目组报告,提取到抗疟活性很好的鹰爪甲素,分离出有效单体并探明了结构,这是一种倍半萜过氧化物,而且也比较稳定。不过鹰爪甲素的提取非常困难,此后这一工作未推进下去。但这一报告提示了青蒿素也有过氧结构的可能性。有机所的吴毓林在获知消息后,立刻做了一个最简单的定性实验,加入碘化钾后,青蒿素溶液变黄了,这是由于其中的碘离子被过氧化物氧化成了碘,说明青蒿素中果然含有过氧基团,此后吴照华通过定量分析实验确认了青蒿素和鹰爪甲素一样是倍半萜过氧化物。 

  除了过氧基团外,吴照华确定了青蒿素另外一个重要基团是内酯基团,有机所还进一步确证了青蒿素的内酯基团可为钠硼氢还原为双氢青蒿素,而分子中的过氧基团则不受影响,还原产率可高于90%,内酯还原后生成内半缩醛,露出一个羟基,由此为以后青蒿素衍生物的制备奠定了基础。 

  当时,有机所的技术和仪器还是不完备,只能推断出初步结构。屠呦呦等同时商请中科院生物物理研究所合作,通过X射线衍射法测定结构。7511月,吴照华和吴毓林把他们与北京中药所倪慕云及此后参与工作的刘静明、樊菊芬一起得到的初步结果告知了生物物理所,到了年底,生物物理所李鹏飞等便得到了准确的青蒿素分子结构。但当时的X射线衍射法不能区分镜像结果,此后又使用了反常散射的X射线衍射法,最终确定了绝对构型。  

  成药 

  验证了青蒿素的药效、判明了青蒿素的结构之后,为克服青蒿素的溶解度差、复发率高等缺点,结构改造工作便提上了日程。1976年,这一任务由523办公室交给了中科院上海药物研究所(以下简称药物所)。在实验中,药物所发现过氧基还原后的脱氧青蒿素无效;而内酯基加氢还原得到的双氢青蒿素效价比青蒿素还要高。但双氢青蒿素的稳定性较差、溶解度也没有多大改善,于是集中力量开发双氢青蒿素的衍生物,药物所李英等合成了双氢青蒿素的醚类、羧酸脂类和碳酸酯类衍生物,发现效价几乎都高于青蒿素,其中双氢青蒿素和甲醇经醚化反应生成的蒿甲醚效价是青蒿素的6倍,而且油溶性很大,被列为重点研究对象。1981年,蒿甲醚注射液就上临床应用了。 

  1977年的523会议上,桂林制药厂刘旭听说了药物所的进展,立刻着手进行青蒿素衍生物的开发,并成功合成了双氢青蒿素的琥珀酸半酯,即后来的青蒿琥酯,它的钠盐水溶性较好,可用于静脉注射,且效价比青蒿素高。在解决制剂问题后,也很快在临床使用了。 

  在“文革”结束后,青蒿素类抗疟药的相关论文相继发表,并主动公开了青蒿素的化学结构,因当时中国没有专利制度,所以也不存在申请专利的问题。青蒿素类抗疟药的疗效迅速引起了世界卫生组织(WHO)的注意,我国也希望能将中国创制的这一系列新药向外出口。在与WHO的较长时间合作中,了解到在药物研制时需要参照药品非临床研究质量管理规范(good  laboratory practice of drug,GLP)、药物临床试 验质量管理规范(good clinical practice,GCP)等国际规范,促进中国建立了《新药审批办法》。青蒿素及其衍生物作为示范,补充完成了三致试验(致癌性、致突变和致畸胎性试验)等毒性试验和按照GCP规范进行的I期和II期临床试验。这样,青蒿素栓、青蒿琥酯注射剂、蒿甲醚注射剂成为《新药审批办法》实施后的前三种新药。到1995年,全国共批准一类新药14个,其中青蒿素类抗疟药就占有5种。在工业生产上,制药厂争取与药品生产质量管理规范(good manufacturing practices,GMP)接轨,先后建立起符合GMP的生产车间,走上了规范化道路,为我国首创的青蒿素类抗疟药进入国际市场扫清了障碍。   

  尾  

  此后,以复方蒿甲醚片(蒿甲醚-本芴醇复方)为代表的青蒿素类复方抗疟药(artemisinin  based  combination  therapy,ACT)相继出世,并与蒿甲醚、青蒿琥酯共同进入WHO《基本药物目录》。复方蒿甲醚片在与诺华公司合作后,顺利进入国际市场。但是在2004年前,95%罹患疟疾的非洲儿童仍只能得到氯喹作为抗疟药,而此时氯喹大多仅能起到退烧作用了。2004年以来,青蒿素类复方抗疟药逐步取代氯喹,成为全球抗疟的首选药品。  

  纵观青蒿素从发现到成为全球一线抗疟药物的三十多年,正如屠呦呦所言:“获得诺贝尔奖是一个很大的荣誉,青蒿素衍生物研究成功是多年研究团队集体攻关的成绩,青蒿素获奖是中国科学家集体的荣誉。是中国的骄傲,也是中国科学家的骄傲?!?/span>523项目内部公开透明的协作精神仍然值得今天的学术界学习。 

  值得欣喜的是,经过多年研究,青蒿素的一些衍生物表现出对 红斑狼疮、白血病等的动物疗效,有关研究正在进行中。以过氧基团为核心的青蒿素结构仍然有着很大的药用潜力,希望相关研究能够继续辉煌,为人类造福。 

  致谢:在本文成稿过程中,记者采访了中国科学院上海有机化学研究所、中国科学院上海药物所参与青蒿素工作的专家,并参考了《青蒿素类抗疟药》等专著和《青蒿素——历史和现实的启示》的等相关研究论文,在此表示感谢。